| 技术指标 | 操作规范 |
|---|---|
| 引物探针 | 必须使用标准附录A指定的ND5基因位点，探针FAM/TAMRA标记，引物浓度400nM |
| PCR体系 | 25μL反应体积：12.5μL 2×Premix，1.5μL引物混合液，2μL模板DNA，9.5μL ddH2O |
| 热循环条件 | 95℃ 10min；95℃ 15s→60℃ 45s，40循环；60℃延伸1min |
验收规范：
- 阴性对照Ct值＞35或无扩增
- 阳性对照Ct值≤30
- 样本Ct值≤32判定为阳性
- 重复检测三次结果一致方可报告
| 场景类型 | 操作要点 |
|---|---|
| 饲料掺假检测 | 取5g粉碎样品，采用CTAB法提取DNA，添加内标基因（18S rRNA）监控提取效率 |
| 清真食品认证 | 对加工肉制品进行梯度稀释（1:5至1:50），设置熔解曲线分析排除非特异性扩增 |
| 马属动物疫病溯源 | 结合线粒体COI基因多重PCR，建立物种特异性扩增体系 |
| 进出口皮革检疫 | 采用磁珠法纯化DNA，添加BSA（0.4mg/mL）消除鞣酸干扰 |
| 难点类型 | 解决方案 |
|---|---|
| 样本抑制物干扰 | 添加0.1% Tween-20降低腐殖酸影响；采用两步稀释法（1:10初筛→1:100精测） |
| 交叉污染风险 | 设置紫外消解舱处理操作区；使用带滤芯枪头；实施分区操作（试剂配制/样本处理/扩增检测分离） |
| 低拷贝数检测 | 采用数字PCR预富集；延长DNA洗脱体积至50μL；使用高灵敏度Taq酶（扩增效率≥90%） |
| 结果判读争议 | 建立Ct值动态阈值（mean+3SD）；比对GenBank数据库进行序列验证；采用Sanger测序复核可疑样本 |
| 标准号 | 标准名称 | 状态 | 发布日期 | 实施日期 |
|---|---|---|---|---|
| NY/T 4735-2025 | 特色农产品价格指数编制与发布规范 | 现行 | 2025-04-27 | 2025-08-01 |